SiRNA (mały interferujący RNA) - budowa, mechanizm, funkcje (2023)

Co to jest mały interferujący RNA (siRNA)?

• Mały interferujący RNA (siRNA), znany również jako krótki interferujący RNA lub cichy RNA, jest rodzajem dwuniciowej cząsteczki RNA, która działa jako część szlaku interferencji RNA (RNAi).
• Hamuje translację, a tym samym hamuje ekspresję niektórych genów o komplementarnych sekwencjach nukleotydowych poprzez degradację mRNA po transkrypcji.
• siRNA różni się fizycznie i funkcjonalnie od innych rodzajów RNA. Inne RNA są zwykle jednoniciowe i składają się z łańcucha polinukleotydowego. Przeciwna strona siRNA jest inna.
• siRNA to cząsteczka, która hamuje ekspresję genów. Jest to również znane jako małe interferujące kwasy rybonukleinowe lub wyciszanie RNA. Oznacza to, że tłumi dyskomfort. Cały proces wyciszania genów za pośrednictwem siRNA jest znany jako interferencja RNA lub knockdown siRNA.
• siRNA to małe fragmenty dwuniciowego RNA z wystającym fragmentem dinukleotydu na końcu 3', które degradują mRNA i hamują syntezę białek.
• Andrew Fire z Carnegie Institution for Science w Waszyngtonie i Craig Mello z University of Massachusetts w Worcester odkryli proces interferencji RNA (RNAi) w 1998 roku, badając ekspresję genów u robaków Caenorhabditis. W 2006 roku otrzymali Nagrodę Nobla za pracę nad RNAi.
• W 1999 roku Science doniósł o odkryciu siRNA i ich funkcji w potranskrypcyjnym wyciszaniu genów (PTGS) w roślinach przez grupę Davida Baulcombe'a w Sainsbury Laboratory w Norwich w Anglii.

właściwości siRNA

• siRNA to niekodująca dwuniciowa cząsteczka RNA.
• Jest również znany jako krótki interferujący RNA i cichy RNA.
• W porównaniu do mikroRNA (miRNA), jego struktura jest krótka i dobrze zdefiniowana, zazwyczaj zawiera od 20 do 24 par zasad.
• Ich końce 3' i 5' są odpowiednio hydroksylowane i fosforylowane.
• Enzym Dicer jest odpowiedzialny za katalizowanie syntezy siRNA.
• Jest używany do kontrolowania ekspresji genów poprzez tłumienie transkrypcji lub translacji, co czyni go potężnym narzędziem w celowaniu leków i opracowywaniu terapii.
• Syntetyczny siRNA z komplementarną sekwencją mógłby teoretycznie wyciszyć dowolny gen, co czyni go ważnym narzędziem do celowania leków i walidacji funkcji genów.
• Przeprowadzono wiele ważnych badań nad zastosowaniem siRNA w różnych dziedzinach badań medycznych.

Struktura siRNA

Naturalnie występujące siRNA mają dobrze zdefiniowaną strukturę składającą się z fosforylowanych końców 5', hydroksylowanych końców 3' i dwóch nawisów.

• SiRNA jest dwuniciowy, ma długość od 20 do 25 nukleotydów i jest dwuniciowy. Pochodzenie siRNA jest egzogenne i hamuje translację białek.
• Oprócz tych cech, jedną z charakterystycznych cech siRNA jest obecność wystającej części 3' OH.
• To dsRNA jest krótsze i ma nawis na jednym końcu.
• Jedna nić podwójnej nici jest znana jako nić kierowcy, a druga jako nić pasażera. Jest również znany jako nić sensowna i nić antysensowna.
• David Baulcombe i współpracownicy opisali udział siRNA w modyfikacjach potranskrypcyjnych w 1999 roku.
• Na poziomie molekularnym składa się z adeniny, uracylu, cytozyny i guaniny.
• Wiązanie fosfodiestrowe łączy dwa sąsiednie nukleotydy, podczas gdy wiązania wodorowe łączą dwa nukleotydy z oddzielnych nici.
• Na końcach 3' obu dinukleotydów brakuje wiązań wodorowych.
• Z długich dsRNA i małych RNA o strukturze spinki do włosów enzym Dicer katalizuje tworzenie siRNA.
• siRNA można również wstrzykiwać do komórek przez transfekcję. W erze postgenomicznej siRNA są niezbędnym narzędziem do potwierdzania aktywności genów i ukierunkowania terapeutycznego, ponieważ każdy gen można w zasadzie wyciszyć za pomocą syntetycznego siRNA z komplementarną sekwencją.

Mechanizm działania siRNA

Proces, w którym natywny siRNA indukuje wyciszanie genów poprzez represję translacji, opisano poniżej.

1. Dicer jest endorybonukleazą, która rozszczepia długie dsRNA, które mogą pochodzić ze spinek do włosów, komplementarnych RNA lub polimeraz RNA zależnych od RNA. Umożliwia to cząsteczkom utworzenie indukowanego RNA kompleksu wyciszającego (RISC).
2. Gdy siRNA dotrze do komórki, łączy się z innymi białkami, tworząc RISC.
3. Gdy siRNA zostanie włączone do kompleksu RISC, jest cięte w celu wytworzenia jednoniciowego siRNA.
4. Kompleks RISC utrzymuje nić, która jest mniej stabilna termodynamicznie ze względu na parowanie zasad na jej końcu 5'.
5. Jednoniciowy siRNA kompleksu RISC może teraz skanować i lokalizować komplementarny mRNA.
6. Kiedy siRNA (składnik kompleksu RISC) wiąże się z docelowym mRNA, wyzwala cięcie mRNA.
7. MRNA jest teraz rozkładane i komórka rozpoznaje je jako nieprawidłowe. Powoduje to degradację mRNA, uniemożliwiając jego translację do aminokwasów, a następnie do białek. W konsekwencji wyciszanie genu kodującego ten mRNA.

siRNA jest również podobny do miRNA. Jednak miRNA pochodzą z krótszych produktów RNA z pętli macierzystej, które zazwyczaj wyciszają geny poprzez represję translacji i mają szerszą specyficzność działania, podczas gdy siRNA zazwyczaj działają poprzez rozszczepianie informacyjnego RNA (mRNA) przed translacją i mają 100% komplementarności, a zatem bardzo ścisły cel specyficzność.

Wewnątrzkomórkowe dostarczanie siRNA

Wewnątrzkomórkowe dostarczanie siRNA pozostaje wyzwaniem. Istnieją trzy główne metody dostarczania siRNA, które różnią się skutecznością i toksycznością.

Zanieczyszczenie krzyżowe

• W tej technice najpierw należy zaprojektować siRNA przeciwko genowi docelowemu.
• Gdy siRNA zostanie zaprojektowane tak, aby było ukierunkowane na określony gen, musi być skutecznie dostarczane przy użyciu protokołu transfekcji.
• Zazwyczaj do dostarczania stosuje się liposomy kationowe, nanocząstki polimerowe i koniugację lipidów.
• Ta metoda jest korzystna, ponieważ może dostarczać siRNA do większości typów komórek, jest wysoce wydajna i powtarzalna oraz jest dostępna w handlu.
• Transfekcja lipofektaminą i neonem to najczęściej stosowane komercyjne środki transfekcyjne dla siRNA.
• Jednak nie jest kompatybilny ze wszystkimi typami komórek i jest nieskuteczny in vivo.

e-commerce

• Impulsy elektryczne są również wykorzystywane do dostarczania siRNA do komórek wewnątrzkomórkowo.
• Fosfolipidy tworzą błonę komórkową, czyniąc ją podatną na działanie pola elektrycznego.
• Kiedy inicjowane są szybkie, ale silne impulsy elektryczne, cząsteczki lipidów przechodzą przemiany fazowe w wyniku ogrzewania i reorientacji.
• Powoduje to powstawanie hydrofilowych porów i miejscowe przerwanie dwuwarstwy lipidowej w błonie komórkowej, co skutkuje czasową utratą półprzepuszczalności.
• Pozwala to na ucieczkę wielu składników wewnątrzkomórkowych, takich jak jony i metabolity, oraz jednoczesne pobieranie leków, sond molekularnych i kwasów nukleinowych.
• Elektroporacja jest korzystna dla komórek, które są trudne do transfekcji, ale przy tej technice bardziej prawdopodobna jest śmierć komórek.
• Metodę tę zastosowano do dostarczania siRNA ukierunkowanego na VEGF do ksenoprzeszczepów guza u nagich myszy, co skutkowało znacznym zmniejszeniem wzrostu guza.

Lewarowanie wirusowe

• Efekty wyciszania genów transfekowanego siRNA są zwykle przejściowe, ale tę trudność można obejść za pomocą strategii RNAi.
• To siRNA może być dostarczane z matryc DNA przez różne rekombinowane wektory wirusowe oparte na retrowirusie, wirusie związanym z adenowirusem, adenowirusem i lentiwirusem.
• Wirus ten jest bardziej skuteczny w dostarczaniu siRNA do komórek docelowych, ponieważ może transformować niedzielące się komórki i bezpośrednio atakować jądro.
• Te specyficzne wektory wirusowe zostały zaprojektowane tak, aby skutecznie ułatwiały transfekcję siRNA do samych nieżywotnych komórek.
• W niektórych przypadkach syntetyczne wektory wirusowe mogą integrować siRNA z genomem komórki, umożliwiając stabilną ekspresję siRNA i długoterminowe wyciszanie genów.
• Ta metoda jest korzystna, ponieważ jest in vivo i skuteczna do transfekcji komórek, które są trudne do transfekcji.
• Może jednak indukować reakcje przeciwwirusowe w niektórych typach komórek, powodując efekty mutagenne i immunogenne.
• Technika ta może zostać wykorzystana do wyciszenia genów w ośrodkowym układzie nerwowym w celu leczenia choroby Huntingtona.

zastosowania siRNA

• System ten jest obecny u prawie wszystkich eukariontów i działa w celu zwalczania infekcji wirusowych. Naukowcy wykorzystują teraz tę wiedzę do terapeutycznego wyciszania genów i regulowania ekspresji genów.
• Obecnie naukowcy tworzą cząsteczki siRNA, które są unikalne dla mRNA genu, który chcą zahamować.
• SiRNA można wstrzyknąć do komórki przy użyciu technik sztucznego transferu genów opartych na wektorach wirusowych lub wektorach niewirusowych.
• Technika ta eliminuje docelowy informacyjny RNA i kontroluje produkcję białka.
• Naukowcy próbują obecnie wykorzystać wyciszanie genów za pośrednictwem siRNA do hamowania genów powodujących raka.
• Techniki nokautu i nokautu genu wykorzystują supresję ekspresji genów, w której pośredniczy siRNA.
• Jest również używany do walidacji celu, co oznacza, że ​​badany gen docelowy może zostać zweryfikowany.
• Jest również używany do badania i identyfikacji szlaków, takich jak między innymi cytokineza, sygnalizacja insuliny i komórkowy mechanizm obronny.
• Ponadto może być używany do badań duplikacji genów i badań funkcjonalnych genów.
• Dostarczanie leków do mózgu za pomocą terapii siRNA opartej na węglu i wolnej od nanocząstek węgla.

Wyzwania

Istnieją jednak przeszkody w stosowaniu siRNA. Czasami cięcie kończy się niepowodzeniem z powodu niedopasowania między siRNA a regionami docelowego mRNA w pobliżu miejsca cięcia. Istnieje więcej niespecyficznych efektów siRNA.

Rozmowa krzyżowa między RNAi a innymi szlakami prowadzi do sporadycznej aktywacji tych niespecyficznych efektorów. Problemy obejmują:

• Komórki ssaków wyzwalają odpowiedź immunologiczną, gdy dwuniciowy RNA, taki jak siRNA, jest mylony z wirusowymi produktami ubocznymi.
• Modyfikacja właściwości termodynamicznych siRNA skutkująca utratą specyficzności pojedynczego nukleotydu.
• Przypadkowe fałszerstwo. Dzieje się tak w wyniku nieumyślnej regulacji w dół genów z niepełną komplementarnością. Budzi to obawy dotyczące interpretacji danych i prawdopodobnie toksyczności.
• Wstrzykuje się zbyt dużo siRNA, wyzwalając wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza. Istnieją dowody na to, że jest to spowodowane aktywacją PKR, czujnika dsRNA, jak również innych odpowiedzi.

W ostatnich latach odkryto metody łagodzenia tych negatywnych skutków. Na przykład celowanie poza celem można częściowo złagodzić, tworząc odpowiednie kontrole i algorytmy, które generują siRNA poza celem. Analiza ekspresji całego genomu, taka jak technologie mikromacierzy, może być wykorzystana do dalszego udoskonalania algorytmów.

Ponadto wewnątrzkomórkowy transport siRNA nadal stwarza trudności. Dominującymi technikami dostarczania są transfekcja, elektroporacja i dostarczanie wirusa. Chociaż nie nadaje się do wszystkich typów komórek i ma ograniczoną skuteczność in vivo, transfekcja jest najczęściej stosowaną z tych technik. Trwają badania mające na celu sprawdzenie, w jaki sposób można ulepszyć te techniki dostarczania.

Pomimo faktu, że dostarczanie wewnątrzkomórkowe jest utrudnione, a siRNA wykazuje niską stabilność i farmakokinetykę, zainteresowanie terapeutycznymi zastosowaniami tej technologii jest coraz większe. Przemysł farmaceutyczny poczynił znaczne inwestycje w badania i rozwój leków siRNA dla szerokiego zakresu chorób i zaburzeń medycznych.

Ze względu na swój skromny rozmiar około 20 par zasad, siRNA mogą przechodzić przez części ciała, w których nie można zastosować większych terapii genowych. Obejmuje to barierę krew-mózg, która w przeszłości powodowała poważne problemy z dostarczaniem leków.

Porozumienie

• Kamaruzman, Nur i Abd Aziz, Noraini i Poh, Chit i Chowdhury, Ezharul. (2019). Sygnalizacja onkogenna w onkogenezie i zastosowania nanoterapeutyków siRNA w raku piersi. Raki. 11.632.10.3390/raki11050632.
• Kumar, M., DeVaux, RS i Herschkowitz, JI (2016). Zmiany molekularne i komórkowe w raku piersi i pojawiające się role lncRNA w inicjacji i progresji raka piersi. Zmiany molekularne i komórkowe w komórce nowotworowej, 563-586. doi:10.1016/bs.pmts.2016.09.011
• Dana H, Chalbatani GM, Mahmoodzadeh H, Karimloo R, Rezaiean O, Morradzadeh A, Mehmandoost N, Moazzen F, Mazraeh A, Marmari V, Ebrahimi M, Rashno MM, Abadi SJ, Gharagouzlo E. Mechanizmy molekularne i funkcje biologiczne siRNA. Int J Biomed Sci. czerwiec 2017; 13(2):48-57. PMID: 28824341; PMCID: PMC5542916.
• wg chemii Rez. 2012, 45, 7, 1014–1025 Opublikowano: 13 marca 2012 r. https://doi.org/10.1021/ar2002254
• Tuschl, T. (2001). Interferencja RNA i małe interferujące RNA. ChemBioChem, 2(4), 239-245. doi:10.1002/1439-7633(20010401)2:4<239::aid-cbic239>3.0.co;2-r
• https://www.astrazeneca.com/r-d/next-generation-therapeutics/small-interfering-rna.html#!
• https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-SiRNA.aspx
• https://mcmanuslab.ucsf.edu/node/268
• https://www.dovepress.com/small-interfering-rnas-sirnas-in-cancer-therapy-a-nano-based-approach-peer-reviewed-fulltext-article-IJN
• https://en.wikipedia.org/wiki/Small_interfering_RNA
• https://www.creative-biolabs.com/gene-therapy/category-small-interfering-rna-sirna-362.htm
• https://geneticeducation.co.in/sirna-small-interfering-rna-structure-and-function/